单分子成像技术来助力！我国科学家揭示植物感应病原体的分子机制
核苷酸结合，富含亮氨酸的重复受体（NLR）是动植物中的主要免疫受体。激活后，拟南芥NLR蛋白ZAR1在体外形成五聚体抵抗小体，并触发植物的免疫反应和细胞死亡。
2021年5月12日，中国科学院遗传发育生物研究所，北京大学，北京师范大学，清华大学等多单位合作，周俭民，陈宇航，何康敏及柴继杰共同通讯在Cell 在线发表题为“The ZAR1 resistosome is a calcium-permeable channel triggering plant immune signaling”的研究论文，该研究采用单分子成像来显示活化的ZAR1蛋白可以在质膜中形成五聚体复合物。
ZAR1抵抗小体在非洲爪蟾卵母细胞中以依赖于位于通道孔中的保守酸性残基Glu11的方式显示离子通道活性。预组装的ZAR1抵抗小体很容易掺入脂质双层中，并表现出钙可渗透的阳离子选择性通道活性。此外，该研究显示ZAR1在植物细胞中的激活导致Glu11依赖的Ca2 +涌入，亚细胞结构的扰动，活性氧的产生以及细胞死亡。因此，该研究结果支持ZAR1抵抗小体充当钙可渗透的阳离子通道，从而触发免疫力和细胞死亡。
2019年4月4日，清华大学柴继杰课题组、中科院遗传发育所周俭民课题组和清华大学王宏伟课题联合同期背靠背发表两篇重量级Science 文章，完成了植物NLR蛋白复合物的组装、结构和功能分析，揭示了NLR作用的关键分子机制，是植物免疫研究的里程碑事件。Ligand-triggered allosteric ADP release primes a plant NLR complex”的研究论文。该研究通过重建了拟南芥中NLB蛋白ZAR1-RKS1和ZAR1-RKS1-PBL2UMP复合物，并分别以3.7和4.3Å的分辨率确定了它们冷冻电子显微镜（cryo-EM）结构，揭示了ZAR1-RKS1识别PBL2UMP和PBL2UMP激活ZAR1的机制，为理解NLR蛋白提供了结构模板！Reconstitution and structure of a plant NLR resistosome conferring immunity”的研究论文。该研究重建了ZAR1-RKS1-PBL2UMP-dATP活性复合体，证明了其复合体在免疫激活过程中进行寡聚化，并揭示了其激活免疫反应的机制！这两项研究在植物免疫研究领域取得历史性的重大突破，填补了人们25年来对植物抗病蛋白认知的巨大空白，将为研究其它抗病蛋白提供范本。
植物先天免疫系统由感知入侵病原体的免疫原性分子模式的细胞表面受体和细胞内核苷酸结合的富含亮氨酸的重复受体（NLR）组成，后者感知被传递到宿主细胞中的病原体效应子促进发病机理。植物NLR可以根据其可变的N末端域进行分类，因此，带有卷曲螺旋（CC）域的称为CNL，带有Toll-白介素1受体（TIR）域的植物被称为TNL，而带有NTL的被称为TNL，类似于RPW8的CC域（CCR）被称为RNL。
NLR也是动物中重要的先天免疫受体。激活后，NLR通常会形成寡聚复合物，在动物中被称为炎性小体，在植物中被称为抵抗小体 。动物炎性小体激活胱天蛋白酶来促进gasdermin蛋白的成熟，gasdermin蛋白在质膜（PM）中形成孔以触发细胞焦亡和免疫反应。植物NLR的激活还导致被调节的细胞死亡，称为超敏反应（HR），但是对HR细胞死亡的性质和潜在机制的了解仍然很少。
ZAR1是具有规范CC域的CNL，它既充当病原体效应子的感应器，又充当信号传导的执行者。重要的是，ZAR1是一亿年前出现的古老NLR，能够感知到越来越多的病原体效应蛋白，包括丁香假单胞菌（Pst）的HopZ1a，HopF1，HopX1，HopO1和HopBA1，以及来自黄单胞菌的XopJ4 。ZAR1通过与一类称为ZRKs的同源假激酶和另一类激酶PBLs关联来感知多种效应蛋白。在病原体感染之前，ZAR1在静止状态下与各种ZRK相互作用。
在将效应物病原体递送至植物细胞中后，预先形成的复合物中的ZRK进一步募集已被效应物翻译后修饰以形成三元复合物的PBL蛋白。之前的结构工作表明，活化的ZAR1-RKS1-PBL2UMP在体外组装成五聚体抵抗小体，每个ZAR1的五个N末端螺旋形成漏斗形结构。进一步的诱变分析表明，漏斗形结构可能充当通道孔。然而，尚不清楚ZAR1低聚物是否在植物细胞中也采用五聚体构型。更重要的是，ZAR1抵抗小体的确切生化功能仍有待阐明。目前尚不清楚ZAR1抵抗小体孔是直接破坏细胞膜还是充当首先杀死细胞之前，触发细胞内信号传导的离子通道。
在这里，该研究显示ZAR1抵抗小体以依赖于通道孔中Glu11保守残基的方式在非洲爪蟾卵母细胞中具有通道活性。预组装的ZAR1抵抗小体很容易掺入脂质双层中，并作为可渗透Ca2 +的阳离子选择性通道。植物细胞中ZAR1的激活会触发Glu11依赖性Ca2 +流入。单分子成像表明，活化的ZAR1可以在PM中形成五聚体抵抗小体，从而支持其在PM中的成孔活性。延时活细胞成像显示ZAR1活化导致依赖Glu11的活性氧（ROS）产生，细胞器结构微扰以及在最后阶段突然破裂的细胞死亡。在一起，该研究结果表明ZAR1通道活性启动免疫信号传导和细胞死亡。